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高通量组织研磨仪对真菌分子的破壁和真菌DNA的提取

文章出处:admin作者:上海净信 人气:发表时间:2018-06-29 14:33

实验目的

对真菌细胞进行破壁,提取其DNA。

实验原理

随着分子生物学技术的进展,PCR相关方法越来越多地被应用到真菌学研究中来,而真菌DNA的提取是包括分子诊断在内的所有实验的基础,简便快捷地提取真菌DNA,且获得的DNA完整、纯度高,对真菌分子生物学的研究有及其重要的意义。

真菌细胞壁以几丁质、葡萄糖为主构成细胞壁骨架,而基质则由多糖、甘露聚糖、糖蛋白、脂质等填充。丝状真菌坚韧厚壁的构成,需要较为繁琐的破壁手段,故真菌DNA的提取较细菌或其他组织细胞难度更大。为保证真菌PCR技术及其相关分子生物学技术的顺利开展,简便快捷地提取真菌DNA,且获得的DNA完整、纯度高,是必须解决的前提条件。

实验材料和器具

样品:真菌类

仪器:高通量组织研磨仪(上海净信,Tissuelyser-48)

耗材:离心管(上海净信,0.4研磨单位),研磨珠(上海净信,6号,1颗)

试剂:TE Buffer,DA Buffer,E Binding Buffer,Elution Buffer

实验步骤

方法1

1.1 取0.1g菌丝加入0.4研磨单位离心管中,加0.08mlTE Buffer,加入石英砂100mg;

1.2 将离心管放入上海净信科技的高通量组织研磨仪Tissuelyser-48中,设置频率13单位振频,研磨10min;

1.3 取出离心管于65°C环境中温浴30min,然后移出;

1.4 加入0.65mlDA Buffer,混合均匀后于冰浴中放置5min;

1.5 放入离心机14000r/min离心3min;

1.6 将上清液转移到一个新的0.5研磨单位离心管中,加0.15ml的E Binding Buffer,并混合均匀,将混合液体转移至Spin column;

1.7 放入离心机6000r/min离心1min,弃去接液管中液体;

1.8 Spin column中加入0.12ml的Wash Buffer,于10000r/min离心30s,弃去接液管中液体;

1.9 重复步骤1.8,弃去接液管中液体后,再10000r/min离心60s,Spin column转到新的EP管中;

1.10 Spin column中加入0.03ml Elution Buffer,室温放置1min。12000 r/min离心60s,并弃去Spin column。

方法2

2.1 取0.1g菌丝加入0.4研磨单位离心管中,加0.08ml10×TE Buffer,加入石英砂100mg;

2.2 将离心管放入上海净信科技的高通量组织研磨仪Tissuelyser-48中,设置频率60hz,研磨2-3min;

2.3 加入0.024ml10%SDS,加入0.002ml蛋白酶K,混匀,65°C环境中水浴30min;

2.4 然后涡旋1min,加入0.024ml5M NaCl,加入1/10体积的10%CTAB(约0.013ml);2.5 于65°C水浴60min,涡旋1min;

2.6 抽提,加入1/2体积(约0.07mi)的Tris饱和酚及1/2体积(约0.07ml)的氯仿:异戊醇(24:1),混匀;

2.7 于离心机14000转离心1min,取上清液到另一离心管中;

2.8 重复步骤2.7 2-3次(视两相界面杂质多少而定)。

2.9 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)混匀,14000转离心10min,取上清液至另一离心管中;

2.10 后开始沉淀,加入0.045ml NH4Ac,轻柔混匀,冰水中放置30min,加入0.6倍体积的异丙醇,混匀,14000转离心10min,弃上清液;

2.11 用1000ul70%乙醇清洗沉淀,室温晾干,加0.04ml TE Buffer溶解沉淀。